Il existe DEUX CATEGORIES DE METHODES d’analyses :
- Les méthodes directes : elles consistent à rechercher et détecter directement l’agent infectieux : virus, bactérie, parasite, moisissure, dans des échantillons de nature diverse.
Ces méthodes font appel aux techniques de biologie moléculaire (PCR), bactériologie, parasitologie et mycologie
- Les méthodes indirectes : elles consistent à rechercher et détecter la présence dans le sérum d’anticorps (Ac) dirigés contre un agent infectieux (virus, bactérie, parasite) responsable d’une maladie animale.
Ce sont les analyses d’Immuno-sérologie qui sont toutes basées sur la réaction antigène – anticorps : ELISA (la plus courante), agglutination, fixation du complément
FOCUS SUR DEUX METHODES
Sérologie par ELISA = Enzyme Linked Immuno Sorbent Essay
Principe
Les antigènes (Ag) issus de virus, bactéries ou parasites sont fixés sur un support solide sous forme d’une microplaque de 96 puits.
- Si le sérum testé contient des anticorps spécifiques (Ac), ceux-ci se lient alors à l’antigène (complexe Ag-Ac).
- Diverses étapes de lavages, distribution, incubation… conduisent à révéler l’apparition ou non d’une coloration dans les puits de la plaque.
Interprétation et expression des résultats ELISA : l’intensité de la coloration est directement proportionnelle à la concentration d’anticorps spécifiques présents dans le sérum (Elisa indirecte) ou inversement proportionnelle (Elisa compétition).
- La densité optique de la coloration est mesurée au spectrophotomètre
- A partir de la valeur de DO de l’échantillon et des témoins, calcul d’un % à comparer à des seuils d’interprétation spécifiques au Kit Elisa,
Détermination de trois plages de résultats : Positif (POS), Négatif (NEG), et Douteux
Biologie moléculaire par PCR (Polymerase Chain Reaction)
La PCR est une méthode de détection par amplification d’une séquence spécifique de l’ADN ou de l’ARN d’un agent pathogène (virus, bactérie, parasite) à partir d’un échantillon biologique, afin d’obtenir une quantité de matériel génétique « visualisable ».
Principe de la PCR temps réel :
- Première étape d’extraction des acides nucléiques (ADN ou ARN) à partir de l’échantillon
- Deuxième étape d’amplification : consiste à amplifier en un bref laps de temps une portion d’ADN en des millions d’exemplaires
- Amplification réalisée grâce à l’action répétée d’une enzyme de polymérisation (Taq polymérase) et l’utilisation d’amorces oligonucléotidiques spécifiques des régions à amplifier
- Succession de cycles thermiques composées de 3 étapes : dénaturation de l’ADN – hybridation des amorces – élongation.
La révélation se fait par détection simultanée de la fluorescence émise par une sonde incorporée au système d’amplification. La fluorescence augmente proportionnellement à la quantité d’ADN amplifiée.
Interprétation
La lecture des courbes de fluorescence et l’interprétation à partir d’un seuil de détection, permettent de partager les échantillons en statut détecté (POS) ou non détecté (NEG).
PERFORMANCE D'UNE METHODE D'ANALYSE
Quelques définitions :
- Sensibilité : probabilité d’obtenir avec cette méthode une réponse positive chez un animal malade ou infecté, (= nombre de positifs au test / totalité des infectés). Le défaut de sensibilité se manifeste par la présence de résultats faux négatifs.
- Spécificité : probabilité d’obtenir avec cette méthode une réponse négative chez un animal dans une population d’animaux indemnes, (= nombre de négatifs / totalité des indemnes). Le défaut de spécificité se manifeste par la présence de faux positifs.
- Détectabilité : aptitude d’un test de diagnostic ou de dépistage à révéler de faibles quantités de la substance étudiée
CONTROLES QUALITE DES ANALYSES (exemple de l'analyse immuno-sérologique ELISA)
Le LVAD 54 est sous Système de Management de la Qualité et est accrédité par le COFRAC. Cette accréditation implique pour le domaine « Essais et analyses en immunosérologie animale » (guide LAB GTA 27) :
- Des protocoles d’analyses qui respectent strictement les protocoles des fournisseurs de Kits, suivant des normes analytiques et des procédures standardisées,
- Des contrôles internes mis en œuvre tout au long de l’analyse :
- Un sérum de référence interne est introduit dans chaque série d’analyses pour vérifier la reproductibilité de la méthode (absence de dérive)
- vérifications des instruments : pipettes (volumes), lecteur ELISA (densités optiques), enceintes pour incubation (températures)…
- vérifications de la non-contamination inter-échantillons, de la traçabilité interne.
- Des contrôles externes réguliers :
- Un audit de surveillance COFRAC tous les 15 mois
- Participations à des Essais Interlaboratoires d’Aptitude organisés tous les ans ou deux ans par les laboratoires de référence (de l’ANSES)
- Utilisation de réactifs (kits) ELISA dont chaque lot est vérifié et agréé par l’ANSES pour le dépistage des maladies réglementées.